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五分鐘速成!二抗選擇最全攻略Get

發表時間:2017-04-01 00:06來源:五分鐘速成!二抗選擇最全攻略Get | 每日生物評論網址:http://www.bio-review.com/antibody-choose/

  當你想花最多5分鐘來選擇二抗時,過程總是另你措手不及。 結合物、F (ab’)2片段、親和純化、輕鏈特異性。。。可選擇性似乎太多了。不要緊,小編和你一起梳理下二抗的各種形式和類型。

  通常二抗都會結合到某個分子上,以方便檢測到二抗(因為一抗大多數都直接和某個抗原片段結合,直接檢測很困難)。

酶標二抗

  二抗常與一些酶如過氧化物酶(通常為辣根過氧化物酶,HRP)或堿性磷酸酶(AP)結合。將二抗與合適的底物孵育可以產生顏色或光以檢測預期的蛋白。比色測定通常用于免疫組織化學(IHC/ICC)或ELISA,而發光底物則用于Western印跡。

生物素標記二抗

  生物素(Biotin)標記的二抗通常用于擴增信號并增加檢測的靈敏性,鏈霉親和素(Streptavidin, SA)與Biotin特異性結合,形成SA-Biotin系統可偶聯抗原、抗體、報告酶、寡核苷酸分子及熒光物質,廣泛用于生物反應檢測系統。

多聚復合物標記二抗

  一些公司研發出多聚復合物標記的二抗和相關的檢測試劑盒。將多聚復合物標記在二抗上,形成類似于章魚的超大抗體-酶復合物,其巨大的復合物所含分子量遠高于常規復合物標記的抗體,更加靈敏和高特異性。強大的組織細胞滲透力及信號放大能力,特別適合應用于IHC及其它需要放大信號的ELISA,蛋白質印跡等。

熒光標記二抗

  熒光標記的二抗與熒光染料結合,通常用于流式檢測(FC),細胞或組織中蛋白質的免疫熒光檢測(IF)。最近,也應用于Western印跡分析的CCD檢測。幾種不同顏色的熒光染料可用于允許同時檢測多種蛋白(雙標或三標)。常用的熒光染料除了經典的AMCA、FITC、Cy3等,目前市面上頂尖的的IFKine、Dylight、Alexa Fluor已然已經成為科研工作者的新寵。詳見http://www.abbkine.com/?s=IFKine&post_type=product&submit=

  選擇二抗的第二個因素是:根據一抗的動物來源和抗體類型(類和亞類)來確定。

動物來源

  二抗必須能識別一抗。如果一抗是小鼠單克隆抗體,分離類型是小鼠IgG1,那么二抗必須選擇抗小鼠IgG的抗體;同樣,如果一抗來源于山羊,二抗必須選擇抗山羊的抗體。

類和亞類

  二抗還必須對應一抗的類和亞類。尤其是一抗是均質的單克隆抗體時,這點 特別重要。例如,一些一抗分離類型是小鼠IgM,而有一些是IgG。購買二抗時注意分別選擇抗小鼠IgM和小鼠IgG的抗體。 小鼠IgG抗體還可以分為各種亞類,如IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgG3。雖然可購買能識別所有亞類的一般的抗小鼠IgG二抗,但盡可能購買抗某一特定亞類的抗體以增加特異性。大多數物種的分離類型都是IgG,物種特異性抗IgG抗體能很好地工作。但注意鳥類或禽類的免疫球蛋白為IgY。

IPkine

抗重鏈或輕鏈二抗

       Ig分子的基本結構是由四肽鏈組成的。即:由二條相同的分子量較小的肽鏈(輕鏈,Light chain)和二條相同的分子量較大的肽鏈(重鏈,Heavy chain)組成。抗原識別結構域為Fab片段。 Fab片段是高度可變的,說明抗體抗原的特異性。每條重鏈和輕鏈還含有稱為保守區的非可變區或稱Fc片段。 可以購買僅識別特定部分(重鏈或輕鏈)的二抗。

  最常見的二抗類型是同時可以抗重鏈和輕鏈的抗體,表示方式為anti-Ig G(H+L)。在免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)和免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation, co-IP) 實驗中,常常因為有限的一抗,IP和WB的操作過程中而不得不用到相同的一抗或同種屬來源的一抗,這種情況下,如果使用常規的Anti-IgG(H+L)二抗,WB實驗中IP抗體變性后產生的重鏈(55kDa)和輕鏈(25kDa)都能夠識別,而此非特異的信號往往會部分甚至完全掩蓋目的蛋白的信號,影響實驗結果。如果目標蛋白分子量小于30Kda,為了避免抗體輕鏈的干擾,推薦您使用重鏈特異性的二抗。如果您的目標蛋白分子量大于30Kda,為了避免抗體重鏈的干擾,推薦您使用輕鏈特異性的二抗。

F(ab’)2或Fab形式二抗

  在IHC或ICC實驗中,有些細胞或組織表面Fc受體較多,為避免二抗與Fc受體非特異性結合,導致高背景,F(ab’)2形式的二抗是更好的選擇。另外,F(ab’)2形式的二抗,其分子本身較小,更容易滲透到細胞、組織內,靈敏度更高。單價的Fab二抗只有一個結合位點,可以用來封閉免疫雙標實驗中同一物種來源的兩種一抗。能有效的解決IF雙標實驗中,兩個一抗來自同一種屬時的困境。

親和純化二抗

  抗體純化的目的是增加抗體的特異性,需要親和純化的抗體通過含有目標抗原的柱子。因此,它們通常能最大限度的減少非特異性結合。另外,親和純化后的抗體是高親和力抗體,可用于檢測低豐度的蛋白。

經血清吸附的二抗

  一些二抗通常會經過人或其它動物IgG吸附。這類抗體能減少非特異性結合,特別適合應用于一些免疫檢測如IHC。如在IHC實驗中,樣本來源于人,則可選擇經人血清吸附的二抗,以避免二抗和樣本發生交叉反應,影響實驗結果。

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